Feltet til bioteknologi er en av konstant endring. Den raske veksten og utviklingen av nyskapende forskning er avhengig av innovasjon og kreativitet forskere og deres evne til å se potensialet i en grunnleggende molekylteknikk og anvende det på nytt prosesser. Fremkomsten av polymerasekjedereaksjon (PCR) åpnet mange dører i genetisk forskning, inkludert et middel til DNA-analyse og identifisering av forskjellige gener basert på deres DNA-sekvenser. DNA-sekvensering er også avhengig av vår evne til å bruke gelelektroforese å skille DNA-tråder som avviker i størrelse med så lite som ett basepar.
DNA-sekvensering
På slutten av 1970-tallet ble det funnet opp to DNA-sekvenseringsteknikker for lengre DNA-molekyler: Sanger (eller dideoxy) -metoden og Maxam-Gilbert (kjemisk spaltning) -metoden. Maxam-Gilbert-metoden er basert på nukleotidspesifikk spaltning av kjemikalier og brukes best til å sekvensere oligonukleotider (korte nukleotidpolymerer, vanligvis mindre enn 50 basepar i lengde). Sanger-metoden er mer ofte brukt fordi den har blitt bevist teknisk lettere å bruke, og, med bruk av PCR og automatisering av teknikken, kan enkelt brukes på lange DNA-tråder inkludert noen hele gener. Denne teknikken er basert på kjedeavslutning av dideoxynukleotider under PCR-forlengelsesreaksjoner.
Sanger-metoden
I Sanger-metoden blir DNA-strengen som skal analyseres brukt som en mal, og DNA-polymerase blir brukt, i en PCR-reaksjon, for å generere komplementære strenger ved bruk av primere. Fire forskjellige PCR-reaksjonsblandinger blir fremstilt, som hver inneholder en viss prosentandel av dideoxynukleosid-trifosfat (ddNTP) -analoger til et av de fire nukleotidene (ATP, CTP, GTP eller TTP).
Syntese av den nye DNA-strengen fortsetter til en av disse analogene er inkorporert, på hvilket tidspunkt tråden er forkortet. Hver PCR-reaksjon vil ende opp med å inneholde en blanding av forskjellige lengder av DNA-tråder, alt ender med nukleotidet som var dideoxy merket for den reaksjonen. gel elektroforese blir deretter brukt til å skille strengene til de fire reaksjonene, i fire separate baner, og bestemme sekvensen til den opprinnelige malen basert på hvilke lengder av tråder som ender med hvilket nukleotid.
I den automatiserte Sanger-reaksjonen brukes primere som er merket med fire forskjellige fargede lysstoffrørmerker. PCR-reaksjoner, i nærvær av de forskjellige dideoxynukleotider, blir utført som beskrevet ovenfor. Imidlertid blir de fire reaksjonsblandinger deretter kombinert og påført på en enkelt bane av en gel. Fargen på hvert fragment blir oppdaget ved hjelp av en laserstråle, og informasjonen blir samlet inn av en datamaskin som genererer kromatogrammer som viser topper for hver farge, fra hvilken malen DNA-sekvensen kan være fast bestemt.
Typisk er den automatiserte sekvenseringsmetoden bare nøyaktig for sekvenser opp til maksimalt 700-800 basepar i lengde. Imidlertid er det mulig å oppnå fulle sekvenser av større gener og faktisk hele genom ved bruk av trinnvise metoder som Primer Walking og Shotgun sequencing.
I Primer Walking sekvenseres en brukbar del av et større gen ved bruk av Sanger-metoden. Nye primere genereres fra et pålitelig segment av sekvensen og brukes til å fortsette sekvensering av delen av genet som var utenfor området for de opprinnelige reaksjonene.
Haglgeværsekvensering innebærer tilfeldig å kutte DNA-segmentet av interesse til mer passende (håndterbare) fragmenter i størrelse, sekvensering av hvert fragment, og ordn stykkene basert på overlapping sekvenser. Denne teknikken er blitt enklere ved bruk av programvare for å arrangere de overlappende stykkene.