Hvordan polymerasekjedereaksjon fungerer for å forsterke gener

Polymerasekjedereaksjonen (PCR) er en molekylærgenetisk teknikk for å lage flere kopier av et gen og er også en del av gensekvenseringsprosessen.

Genkopier lages ved hjelp av en prøve av DNA, og teknologien er god nok til å lage flere kopier fra én enkelt kopi av genet som finnes i prøven. PCR-amplifisering av et gen for å lage millioner av kopier, muliggjør deteksjon og identifikasjon av gensekvenser ved bruk av visuelle teknikker basert på størrelse og ladning (+ eller -) av DNA-stykket.

Under kontrollerte forhold genereres små segmenter av DNA av enzymer kjent som DNA-polymeraser, som tilfører komplementære deoksynukleotider (dNTPs) til et stykke DNA kjent som "malen". Selv mindre biter av DNA, kalt "primere" brukes som utgangspunkt for polymerase.

Primere er små menneskeskapte biter av DNA (oligomerer), vanligvis mellom 15 og 30 nukleotider lange. De lages ved å kjenne eller gjette korte DNA-sekvenser helt i enden av genet som forsterkes. Under PCR varmes DNA-et som sekvenseres opp og dobbelttrådene skilles. Ved avkjøling binder primerne seg til malen (kalt annealing) og skaper et sted for polymerasen å begynne.

Polymerasekjedereaksjonen (PCR) ble gjort mulig ved oppdagelsen av termofile og termofile polymeraseenzymer (enzymer som opprettholder strukturell integritet og funksjonalitet etter oppvarming til høy temperaturer). Trinnene involvert i PCR-teknikken er som følger:

• Det lages en blanding med optimaliserte konsentrasjoner av DNA-malen, polymerase-enzymet, primere og dNTP-er. Evnen til å varme opp blanding uten å denaturere enzymet muliggjør denaturering av den doble helixen av DNA-prøven ved temperaturer i området 94 grader Celsius.
• Etter denaturering avkjøles prøven til et mer moderat område, rundt 54 grader, noe som letter annealingen (bindingen) av primerne til de enkelttrådete DNA-templatene.
• I det tredje trinnet av syklusen varmes prøven opp til 72 grader, den ideelle temperaturen for Taq DNA Polymerase, for forlengelse. Under forlengelse bruker DNA-polymerase den originale enkeltstrengen av DNA som en mal for å legge til komplementære dNTP-er til 3'-endene av hver primer og generer en del av dobbelttrådet DNA i området til genet av interesse.
• Primere som har annealet til DNA-sekvenser som ikke er en eksakt match, forblir ikke annealet ved 72 grader, og begrenser dermed forlengelsen til genet av interesse.

Denne prosessen med denaturering, annealing og forlengelse gjentas flere (30-40) ganger, og øker dermed eksponentielt antall kopier av det ønskede genet i blandingen. Selv om denne prosessen ville være ganske kjedelig hvis den utføres manuelt, kan prøver tilberedes og inkuberes i en programmerbar Thermocycler, nå vanlig i de fleste molekylære laboratorier, og en fullstendig PCR-reaksjon kan utføres i 3-4 timer.

Hvert denatureringstrinn stopper forlengelsesprosessen til den forrige syklusen, og trunkerer dermed den nye DNA-strengen og holder den til omtrent størrelsen på det ønskede genet. Varigheten av forlengelsessyklusen kan gjøres lengre eller kortere avhengig av størrelsen på genet av interesse, men til slutt, gjennom gjentatte sykluser av PCR, vil flertallet av malene være begrenset til størrelsen på genet av interesse alene, da de vil ha blitt generert fra produkter fra begge primere.

Det er flere forskjellige faktorer for vellykket PCR som kan manipuleres for å forbedre resultatene. Den mest brukte metoden for å teste for tilstedeværelsen av PCR-produkt er agarosegelelektroforese. Som brukes til å skille DNA-fragmenter basert på størrelse og ladning. Fragmentene blir deretter visualisert ved bruk av fargestoffer eller radioisotoper.

Siden oppdagelsen av PCR har andre DNA-polymeraser enn den opprinnelige Taq blitt oppdaget. Noen av disse har bedre "korrekturlesende" evne eller er mer stabile ved høyere temperaturer, og forbedrer dermed spesifisiteten til PCR og reduserer feil ved innsetting av feil dNTP.

Noen varianter av PCR er designet for spesifikke bruksområder og brukes nå regelmessig i molekylærgenetiske laboratorier. Noen av disse er sanntids-PCR og omvendt-transkriptase-PCR. Oppdagelsen av PCR har også ført til utviklingen av DNA-sekvensering, DNA-fingeravtrykk og andre molekylære teknikker.