Metoder for proteinrensing i bioteknologi

En viktig komponent i bioteknologisk forskning er bruken av proteinteknikk for å designe eller modifisere proteiner. Disse proteinrensingsteknikkene optimaliserer proteinegenskapene for spesifikke industrielle anvendelser.

Disse teknikkene krever at forskere isolerer og renser proteiner av interesse, slik at deres konformasjoner og substratspesifisiteter kan studeres. Reaksjoner med andre ligander (et protein som er knyttet til et reseptorprotein) og spesifikke enzymaktiviteter, som også krever studier.

Graden av proteinrenhet som kreves avhenger av den tiltenkte sluttbruken av proteinet. For noen bruksområder er et råekstrakt tilstrekkelig. Andre bruksområder, som i matvarer og farmasøytiske stoffer, er et høyt nivå av renhet. Flere teknikker for proteinrensing brukes til å nå et påkrevet renhetsnivå.

Hvert proteinrensetrinn resulterer vanligvis i en viss grad av produkttap. Derfor er en ideell proteinrensingsstrategi en der det høyeste nivået av rensing nås i de færreste trinn.

Valget av hvilke trinn som skal brukes er avhengig av målproteinets størrelse, ladning, løselighet og andre egenskaper. Følgende teknikker er mest passende for rensing av et enkelt cytosolisk protein.

Rensing av cytosoliske proteinkomplekser er mer komplisert og krever vanligvis at forskjellige metoder anvendes.

Det første trinnet i å rense intracellulære proteiner (inne i cellen) er fremstillingen av et råekstrakt. Ekstraktet vil inneholde en kompleks blanding av alle proteiner fra cellecytoplasma, og noen ekstra makromolekyler, kofaktorer og næringsstoffer.

Dette råekstraktet kan brukes til noen anvendelser innen bioteknologi. Imidlertid, hvis renhet er et problem, må påfølgende rensetrinn følges. Råproteinekstrakter blir fremstilt ved fjerning av cellulær rusk generert ved cellelys, som oppnås ved bruk av kjemikalier, enzymer, lydbehandling eller en fransk presse.

Avfallet fjernes ved sentrifugering, og supernatanten (væsken over en fast rest) utvinnes. Råpreparater av ekstracellulære proteiner (utenfor cellen) kan oppnås ved ganske enkelt å fjerne cellene ved sentrifugering.

Helt sikkert bioteknologi bruksområder, er det etterspørsel etter termostabile enzymer - enzymer som tåler høye temperaturer uten denaturering, mens de opprettholder høy spesifikk aktivitet.

Organismer som produserer varmebestandige proteiner kalles noen ganger ekstremofile. En enkel tilnærming til å rense et varmebestandig protein er å denaturere de andre proteinene i blandingen ved oppvarming, og deretter avkjøling av løsningen (slik at det termostabile enzymet kan reformeres eller gjenoppløses, hvis nødvendig). De denaturerte proteiner kan deretter fjernes ved sentrifugering.

Moderne bioteknologi protokoller utnytter ofte de mange kommersielt tilgjengelige settene eller metodene som gir ferdige løsninger for standardprosedyrer. Proteinrensing blir ofte utført ved bruk av filtre og tilberedte gelfiltreringskolonner.

Følg dialysesettets instruksjoner og legg til riktig volum av riktig løsning og vent til spesifisert tidsperiode mens oppsamling av elueringsmiddel (løsningsmidlet passert gjennom kolonnen) i en fersk test rør.

Kromatografiske metoder kan brukes ved bruk av topp-kolonner eller automatisert HPLC-utstyr. Separasjon ved HPLC kan gjøres ved omvendt fase, ionebytte eller størrelsesekskluderingsmetoder, og prøver detektert ved hjelp av diodesystem eller laserteknologi.

Tidligere var et vanlig andre trinn for å rense et protein fra et råekstrakt ved utfelling i en løsning med høy osmotisk styrke (dvs. saltløsninger). Proteinutfelling gjøres vanligvis ved bruk av ammoniumsulfat som salt. Nukleinsyrer i råekstraktet kan fjernes ved å utfelle aggregater dannet med streptomycinsulfat eller protaminsulfat.

Saltutfelling fører vanligvis ikke til et sterkt renset protein, men kan bidra til å eliminere noen uønskede proteiner i en blanding, og ved å konsentrere prøven. Salter i oppløsningen fjernes deretter ved dialyse gjennom porøs celluloserør, filtrering eller geleksklusjonskromatografi.

Ulike proteiner vil utfelle i forskjellige konsentrasjoner av ammoniumsulfat. Generelt sett utfeller proteiner med høyere molekylvekt i lavere konsentrasjoner av ammoniumsulfat.

Reverse-fase kromatografi (RPC) skiller proteiner basert på deres relative hydrofobicitet (eksklusjon av ikke-polare molekyler fra vann). Denne teknikken er svært selektiv, men krever bruk av organiske løsningsmidler.

Noen proteiner blir permanent denaturert av løsningsmidler og vil miste funksjonalitet under RPC. Derfor anbefales ikke denne metoden for alle anvendelser, spesielt hvis det er nødvendig at målproteinet beholder aktiviteten.

Ionbytterkromatografi refererer til separasjon av proteiner basert på ladning. Søyler kan enten være forberedt for anionbytte eller kationbytte. Anionbytterkolonner inneholder en stasjonær fase med en positiv ladning som tiltrekker seg negativt ladede proteiner.

Kationbytterkolonner er de omvendte, negativt ladede perler som tiltrekker seg positive ladede proteiner. Eluering (ekstrahering av ett materiale fra et annet) av målproteinet (er) gjøres ved å endre pH i kolonnen, som resulterer i en endring eller nøytralisering av de ladede funksjonelle gruppene for hver protein.

Størrelseseksklusjonskromatografi (også kjent som gelfiltrering) skiller større proteiner fra mindre de siden de større molekylene reiser raskere gjennom den tverrbundne polymeren i kromatografien kolonne. De store proteinene passer ikke inn i porene til polymeren, mens mindre proteiner gjør det, og det tar lengre tid å reise gjennom kromatografisøylen, på en mindre direkte rute.

Eluat (resultatet av eluering) blir samlet i en serie rør som skiller proteiner basert på elueringstid. Gelfiltrering er et nyttig verktøy for å konsentrere en proteinprøve siden målproteinet blir samlet i et mindre elueringsvolum enn det som først ble satt til kolonnen. Lignende filtreringsteknikker kan brukes under storskala proteinproduksjon på grunn av deres kostnadseffektivitet.

Affinitetskromatografi er en veldig nyttig teknikk for å "polere", eller fullføre proteinrensingsprosessen. Perler i kromatografisøylen er tverrbundet til ligander som binder spesifikt til målproteinet.

Proteinet fjernes deretter fra kolonnen ved å skylle med en løsning som inneholder frie ligander. Denne metoden gir de reneste resultatene og den høyeste spesifikke aktiviteten sammenlignet med andre teknikker.

SDS-PAGE (natriumdodecylsulfat brukt sammen med polyakrylamidgelelektroforese) binder seg til proteiner som gir dem en stor netto negativ ladning. Siden ladningene for alle proteiner er ganske like, skiller denne metoden dem nesten utelukkende basert på størrelse.

SDS-PAGE brukes ofte til å teste renheten av protein etter hvert trinn i en serie. Når uønskede proteiner gradvis fjernes fra blandingen, reduseres antall bånd visualisert på SDS-PAGE-gelen til det bare er et bånd som representerer det ønskede protein.

Immunoblotting er en proteinvisualiseringsteknikk brukt i kombinasjon med affinitetskromatografi. Antistoffer for et spesifikt protein blir brukt som ligander på en affinitetskromatografikolonne.

Målproteinet blir holdt på kolonnen, deretter fjernet ved å skylle kolonnen med en saltoppløsning eller andre midler. Antistoffer knyttet til radioaktive eller fargestoffetiketter hjelper til med å påvise målproteinet når det er separert fra resten av blandingen.