DNA-forsterkning gjennom polymerasekjedereaksjon

PCR står for polymerase kjedereaksjon, en molekylærbiologisk teknikk for å amplifisere segmenter av DNA, ved å generere flere kopier ved bruk av DNA-polymeraseenzymer under kontrollerte forhold. Så lite som en enkelt kopi av et DNA-segment eller gen kan klones i millioner av kopier, noe som tillater påvisning ved bruk av fargestoffer og andre visualiseringsteknikker.

Prosessen med PCR ble utviklet i 1983 og har gjort det mulig å utføre DNA-sekvensering og identifisere rekkefølgen på nukleotider i individuelle gener. Metoden bruker termisk sykling eller gjentatt oppvarming og avkjøling av reaksjonen for DNA-smelting og replikasjon. Når PCR fortsetter, brukes det "nye" DNA som en mal for replikasjon og en kjedereaksjon oppstår, og eksponentielt amplifiserer DNA-malen.

PCR-teknikker brukes på mange områder innen bioteknologi, inkludert proteinteknikkkloning, rettsmedisiner (DNA-fingeravtrykk), farskapstesting, diagnose av arvelige og / eller smittsomme sykdommer, og for analyse av miljøprøver.

Spesielt innen rettsmedisiner er PCR spesielt nyttig fordi det forsterker selv den minste mengden DNA-bevis. PCR kan også brukes til å analysere DNA som er tusenvis av år gammelt, og disse teknikkene har blitt brukt for å identifisere alt fra en 800 000 år gammel mammut til mumier fra hele verden.

Dette trinnet er bare nødvendig for DNA-polymeraser som krever PC-start med varm start. Reaksjonsblandingen oppvarmes til mellom 94 og 96 ° C og holdes i 1-9 minutter.

Hvis prosedyren ikke krever initialisering, er denaturering det første trinnet. Reaksjonsblandingen oppvarmes til 94-98 ° C i 20-30 sekunder. DNA-malets hydrogenbindinger blir forstyrret og enkeltstrengede DNA-molekyler blir opprettet.

Reaksjonstemperaturen er lavere til mellom 50 og 65 ° C og holdes i 20-40 sekunder. Primerne annealer til den enstrengede DNA-malen. Temperaturen er ekstremt viktig i dette trinnet. Hvis det er for varmt, kan det hende at primeren ikke binder seg. Hvis det er for kaldt, kan det hende at grunningen binder seg ufullkommen. En god binding dannes når primersekvensen stemmer godt overens med malsekvensen.

Temperaturen i løpet av dette trinnet varierer avhengig av typen polymerase. DNA-polymerasen syntetiserer en helt ny DNA-streng.

Dette trinnet utføres ved 70-74 ° C i 5-15 minutter etter den endelige PCR-syklusen.

Dette trinnet er valgfritt. Temperaturen holdes ved 4-15 ° C og striper reaksjonen.

I løpet av hver syklus dobles produktet (den spesifikke DNA-delen som blir replisert).

Når DNA-polymerasen mister aktivitet og konsumerer reagenser, reduseres reaksjonen.

Ingen flere produkter akkumuleres.